連接計算器
分類：生物學
- 2025年4月2日
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載體 DNA
插入片段 DNA
連接反應設置
建議的插入片段量
8.3 ng
0.33 μL 插入片段庫存
載體量
50 ng
使用 1 μL 載體庫存
插入片段:載體比例
3:1 (摩爾比)
適用於標準克隆
完整反應設置
| 組件 | 體積 (μL) | 最終量 |
|---|---|---|
| 載體 DNA (50 ng/μL) | 1.0 | 50 ng |
| 插入片段 DNA (25 ng/μL) | 0.33 | 8.3 ng |
| 10× T4 DNA 連接酶緩衝液 | 2.0 | 1× |
| T4 DNA 連接酶 | 1.0 | 400 U |
| 無核酸酶水 | 15.67 | 至 20 μL |
| 總體積 | 20.0 |
優化提示
根據您的輸入參數，以下是一些建議:
- 對於 5' 黏性末端，載體:插入片段比例為 1:3，建議在 16°C 下孵育 4 小時。
- 對載體進行 CIP 處理可減少自連接背景。
- 如果轉化效率低，嘗試將插入片段:載體比例提高至 5:1。
- 對於平末端連接，增加連接酶濃度並延長連接時間。
- 在轉化前，將連接酶在 65°C 下加熱失活 10 分鐘以獲得最佳效果。
關於 DNA 連接
- DNA 連接涉及通過形成磷酸二酯鍵將 DNA 片段連接在一起。
- T4 DNA 連接酶需要 ATP 和 Mg²⁺ 才能正常運作 (由連接緩衝液提供)。
- 黏性末端連接比平末端連接更高效。
- 載體:插入片段摩爾比通常在 1:3 到 1:5 之間，用於標準克隆。
- 對於平末端連接或較大的插入片段，建議使用更高的插入片段:載體比例 (3:1 到 10:1)。
- 對載體進行去磷酸化處理 (使用 CIP、SAP 等) 可防止載體自連接。
- 快速連接系統可將連接時間縮短至室溫下的 5-15 分鐘。
插入量公式 (ng):
\[ \text{插入 ng} = \left( \frac{\text{載體 ng} \times \text{插入大小 (kb)}}{\text{載體大小 (kb)}} \right) \times \left( \frac{\text{插入摩爾數}}{\text{載體摩爾數}} \right) \]
什麼是連接計算器？
連接計算器是一種工具，幫助研究人員確定成功的連接反應所需的載體和插入 DNA 的適當量。DNA 連接是分子克隆中的一個關鍵步驟，其中 DNA 插入通過一種稱為 DNA 連接酶的酶與質粒載體結合。
它是如何工作的？
這個計算器允許用戶輸入有關其載體和插入的詳細信息，包括長度和濃度。根據選擇的摩爾比，它計算所需的插入 DNA 量，以實現最佳的連接反應。
主要特點
- 計算不同克隆情境下的載體與插入的摩爾比。
- 支持標準和自定義摩爾比。
- 根據粘性或平端克隆提供連接條件的建議。
- 包括改善連接效率的優化提示。
如何使用計算器
- 輸入載體長度 (bp) 和濃度 (ng/μL)。
- 輸入插入長度 (bp) 和濃度 (ng/μL)。
- 選擇所需的載體與插入的摩爾比 (例如，1:3，1:5)。
- 指定總反應體積 (例如，20 μL)。
- 對於高級設置，選擇連接溫度、持續時間、連接酶類型和載體處理選項。
- 點擊“計算”以生成建議的插入量和反應設置。
常見問題
最佳的載體與插入摩爾比是多少？
對於粘性端連接，通常建議使用 1:3 或 1:5 的載體與插入比。對於平端連接，較高的比率 (例如，1:5 到 1:10) 可能會提高效率。
為什麼建議對載體進行去磷酸化？
去磷酸化（使用 CIP、SAP 或南極磷酸酶）可以防止載體的自我連接，減少不必要的背景菌落。
我應該使用什麼連接條件？
- 16°C 4 小時 – T4 DNA 連接酶的標準條件。
- 室溫 15 分鐘 – 適合快速連接酶。
- 16°C 過夜 – 建議用於挑戰性的連接或平端克隆。
我如何提高連接效率？
- 確保載體和插入的摩爾比正確。
- 使用新鮮的 DNA 連接酶和緩衝液。
- 優化連接條件（溫度和持續時間）。
- 在連接之前通過凝膠電泳確認插入的存在。
為什麼使用這個計算器？
這個連接計算器簡化了 DNA 連接反應的設置，幫助研究人員確定有效克隆所需的載體和插入的正確量。通過自動化計算和提供優化提示，它節省了時間並提高了連接實驗的成功率。